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一文练习Luciferase(最全) Luciferase 呈报基因编造举措及道理先容
发布时间:2021-12-06 18:12:46 来源:亚博188 作者:亚博88

  原题目:一文进修Luciferase(最全) Luciferase 呈文基因体例形式及道理先容

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  Luciferase呈文基因体例是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种呈体裁例。荧光素酶可能催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin,正在 luciferin 氧化的历程中,会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可能通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化历程中开释的生物荧光。荧光素和荧光素酶这生平物发光系统,可能极其聪颖、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与主意 基因启动子区 DNA 彼此用意的一种检测形式。

  转录因子是一种拥有独特布局、行使调控基因表告竣效的卵白质分子,也称为反式用意因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列连系,这些特异性的序列被称为顺式用意元件,转录因子的 DNA 连系域温柔式用意元件告竣共价连系,从而对基因的表达起箝造或加强的用意。荧光素酶呈文基因实践(luciferase assay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异挨次连系的紧张机谋。

  (1)构修一个将靶启动子的特定片断插入到荧光素酶表达序列前线的呈文基因质粒,如 pGL3-basic 等。

  (2) 将要检测的转录因子表达质粒与呈文基因质粒共转染HEK293T细胞或其它相干的细胞系。借使此转录因子或许激活靶启动子,则荧光素酶基因就会表达,荧光素酶的表达量与转录因子的用意强度成正比。

  (3) 参加特定的荧光素酶底物,荧光素酶与底物反响,爆发荧光,通过检测荧光的强度可能测定荧光素酶的活性,从而鉴定转录因子是否能与此靶启动子片断有效意。

  1、实践第一天,消化并接种细胞(凭据实在实践遴选适合的细胞)于 35 mm 细胞造就皿,置于 5% CO2、饱和湿度的 37℃造就箱内造就住宿。

  2、等细胞密度抵达70%时用 Luciferase 呈文基因质粒、LacZ 的表达质粒及其 它质粒(凭据实在实践确定)共转染细胞(凭据实在实践遴选转染形式,如磷酸钙重淀法、PEI、lipofectamine2000 等均可)。

  3、转染 24-36 幼时后,吸去造就液,用酷寒的 PBS 洗涤细胞。注:荧光酶的酶促反响会被痕量的钙所箝造,故用磷酸钙转染的细胞正在采集细胞前应充实洗 涤除去含钙介质。

  6、挨次取等体积的细胞裂解液(100 μl)至办法 5 中的离心管中,赶速混匀,正在 发光仪(Luminometer)上读取吸光值。注:发光反响会赶速衰减,将细胞裂解液参加反响液后 5 秒内务必读取吸光值。

  8、取糟粕裂解液测定 LacZ 的活性,其读数举动内标用以矫正荧光素酶的读数。

  9、用矫正后的读数作图,阐述数据。注:荧光素见光易氧化,已稀释未用的荧光素应丢掉。

  1、为博得最佳测定成果,正在用单管的荧光测定仪测依时,样品和测定试剂夹杂后到测 定前的韶华应尽量限定正在好像韶华内,比方 30 秒内。

  2、因为温度对酶反响有影响,因此测依时样品和试剂均需抵达室温后再举行测定。

  3、为包管荧光素酶检测试剂的不乱性,可能采纳符合分装后避光存在的形式,以避免 几次冻融和长韶华袒露于室温。日常来说,借使不分装利用三次(岁月冻融三次),对测定结 果无显明影响。

  4、样品和测定试剂夹杂后,务必等候 1-2 秒,再举行测定。测定韶华一样为 10 秒,根 据处境也可能测定更长或更短韶华,可是统一批样品最好利用好像的测定韶华。

  5、为避免因为质粒转细胞时服从的分别而带来的偏差,可能同时转入 Renilla 荧光素酶 的呈文基因质粒举动内。

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